Methoden

Zur Diagnostik bedient sich die Pathologie einer Reihe von Methoden. Im Zentrum steht nach der makroskopischen Betrachtung die mikroskopische Untersuchung; entsprechend ist das Mikroskop das Hauptarbeitsgerät des Pathologen. Ist jedoch eine sichere und vollständige Beurteilung mit üblicher Mikroskopie nicht möglich - was häufig vorkommt - stehen eine Reihe von diagnostischen Spezialtechniken zur Verfügung (Immunhistologie, Molekularpathologie, Elektronenmikroskopie).

Die Histologie bildet den Schwerpunkt der diagnostischen Tätigkeit eines pathologischen Instituts. Untersucht werden Gewebeproben mit intakten Zellverbänden. Damit können nicht nur die Merkmale einzelner Zellen, sondern auch die ihrer Organisation zu Zellverbänden (histologische Merkmale) diagnostisch beurteilt werden. Insbesondere in der Krebsdiagnostik ist die Histopathologie allen anderen Diagnoseverfahren überlegen.

Nach der Art des übersandten Materials lässt sich zwischen Biopsaten (zu diagnostischen Zwecken entnommene Gewebeproben) und Resektaten (Operationspräparaten) unterscheiden, welche beide histopathologisch untersucht werden. Einen diagnostischen Sonderfall bilden die Schnellschnitte.

Die histologische Beurteilung des eingesandten Materials durch den Pathologen am Mikroskop erfordert sog. "Schnitte". Deren komplizierte Herstellung erfolgt im histologischen Labor durch spezialisiertes Personal. Unter den zahlreichen histotechnischen Varianten hat sich als pathologische Routinemethode die Hämatoxylin-Eosin-Färbung von formalin-fixiertem, paraffin-eingebettetem Gewebe etabliert. Trotz Automatisierung wesentlicher Teilschritte (vor allem Entwässerung, Einparaffinierung und Färbung) bleibt dabei viel manuelle Tätigkeit. Besonderes Geschick erfordert die Herstellung ultrafeiner Schnitte am Mikrotom und deren Aufziehung auf Objektträger.

Die Zytopathologie - die kleine Schwester der Histopathologie - ist eine mikroskopische Methode hauptsächlich zur Tumordiagnostik (Krebs) mittels einzelner Zellen, welche zu diesem Zweck aus verschiedenen Regionen bzw. Organen des Körpers entnommen, auf einem Glasobjektträger ausgestrichen und gefärbt werden, bevor sie ein Pathologe unter dem Mikroskop begutachtet.

Zytologisches Untersuchungsmaterial besteht – im Unterschied zu histologischem – aus einzelnen, aus ihrem Gewebeverband herausgelösten Zellen bzw. kleinen Zellverbänden. Ähnlich wie der Kliniker bei Biopsien am lebenden Patienten Gewebeproben zu diagnostischen Zwecken gezielt aus bestimmten Körperregionen bzw. -Organen gewinnt, kann er auch zellhaltiges Material entnehmen und in die Pathologie zur zytologischen Diagnostik einsenden. Dabei ist das zytologische Untersuchungsspektrum fast so weit wie das der Biopsien, d. h. Zellmaterial lässt sich aus zahlreichen Körperregionen und Organen entnehmen. Quantitativ im Vordergrund steht die Abstrichzytologie des Muttermunds zur Früherkennung des Gebärmutterhalskrebses (Zervixkarzinom), doch auch anderes Material wie Sputum, Bronchialsekret, Urin, Ergussflüssigkeit (Pleuraerguss, Aszites) und Punktate aus diversen Organen wie z. B. Schilddrüse und Lymphknoten wird häufig zytologisch untersucht. Nach der Art der häufigsten Materialgewinnung unterscheidet man zwischen Punktions- und Abstrichzytologie.

Im Vergleich zur histologischen Untersuchung von Biopsaten besitzt die Zytologie Vorteile bei der Materialgewinnung, die - da überwiegend unblutig und schmerzfrei - den Patienten nicht oder nur wenig beeinträchtigt. Dem steht als hauptsächlicher Nachteil die Beschränkung der Beurteilung auf zytologische Kriterien (Eigenschaften von Einzelzellen) gegenüber, d. h. histologische Merkmale, wie Gewebestruktur und deren Zerstörung durch Tumorinvasion, stehen diagnostisch nicht zur Verfügung. Dies beschränkt auch die diagnostische Aussagekraft, so dass nicht selten zweifelhafte zytologische Befunde per Biopsie histologisch überprüft werden.

Beiden Methoden gemeinsam ist die Abhängigkeit vom Vorhandensein diagnostischer Zellen im Untersuchungsgut: Ähnlich wie die histologische Diagnostik von Biopsien voraussetzt, dass suspekte Gewebeanteile im Biopsat vorliegen, steht und fällt die zytologische Diagnostik mit der Präsenz suspekter Zellen im Untersuchungsgut, was z. B. bei Punktaten von Höhlenergüssen nur bei vorherigem spontanen Abschilfern der fraglichen Zellen der Fall ist.

Zytologische Nachuntersuchungen auf der Basis des eingesandten Materials sind meistens nicht oder nur eingeschränkt möglich wegen fehlender Paraffineinbettung. Dem steht jedoch die meist problemlose Gewinnung von frischem Untersuchungsmaterial gegenüber, im Gegensatz zu - weil auf einem invasiven Verfahren beruhend - Biopsien, die wiederum wegen ihrer regelmäßigen Paraffineinbettung Nachuntersuchungen am selben Material erlauben.

Die Qualität der Einsendungen im zytologischen Labor differiert und hat einen entscheidenden Einfluss auf die Begutachtung. Wichtig ist neben einer korrekten Technik der Materialentnahme ein guter Erhaltungszustand der Zellen, der eine korrekte Fixation erfordert, wenn das Untersuchungsmaterial nicht unverzüglich auf kürzestem Weg in die Pathologie gebracht wird.

Durchgeführt wird das gesamte diagnostische Spektrum neuropathologischer Untersuchungen, insbesondere

• Autoptische Untersuchungen von Gehirn und Rückenmark
• Schnellschnittdiagnostik (hauptsächlich von Hirntumoren)
• Begutachtungen von Biopsien aus dem Bereich des zentralen Nervensystems
• Zytologische Liquordiagnostik

Die Immunhistochemie (IHC) ist eine Methode zur spezifischen Markierung von Proteinen mittels monoklonaler Antikörper (AK), die mit einem Detektionssystem kombiniert werden, so dass lichtmikroskopisch erkennbar wird, ob bzw. wo in diversen Zellarten und Geweben ein fragliches Protein vorhanden ist. Während der Einsatz der AK-Färbung anfänglich auf Frischmaterial beschränkt war, sind die gegenwärtig industriell produzierten AK paraffingängig und somit in der Routinediagnostik einsetzbar.

Schon kurze Zeit nach ihren Aufkommen in den 80er Jahren des 20. Jhhs. wurde an der Würzburger Pathologie ein entspr. IHC-Labor eingerichtet, dessen Bedeutung für das Institut parallel zur Bedeutung der neuen Methode für die pathologische Diagnostik gewaltig angewachsen ist. Bei über 150 derzeit im Einsatz befindlichen Primärantikörpern werden momentan ca. 500 immunhistochemische Färbungen pro Tag durchgeführt, d. h. über 100.000 pro Jahr. Hauptanwendungsgebiete sind die Hämatopathologie mit dem Referenzzentrum für Lymphknotenpathologie mit einem Anteil von ca. 2/3 sämtlicher Färbungen sowie die Tumordiagnostik (Diagnose, Klassifizierung sowie Bestimmung von prognostischen sowie therapierelevanten Faktoren).

Seit Aufkommen der Molekulargenetik bzw. -Pathologie im letzten Viertel des 20. Jahrhunderts hat die neue Methode im letzten Jahrzehnt in der pathologischen Diagnostik enorme Bedeutung gewonnen. Dies führte folgerichtig zur Einrichtung spezialisierter Labors, in der Würzburger Pathologie im Jahre 1998 (Link zum Labor). Seitdem wurde das Spektrum molekulargenetischer Untersuchungen kontinuierlich ausgeweitet. Methodisch basieren sie überwiegend auf der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR), Sequenziertechniken und Elektrophorese. Die junge Technik mit hohem Wachstumspotential verspricht, die pathologische Diagnostik insbesondere auf dem Gebiet der Tumoren in naher Zukunft zu revolutionieren.

Entsprechend dem hämatologischen Schwerpunkt des Instituts stehen in der täglichen Routinediagnostik des Würzburger Labors molekulargenetische Untersuchungen zum Nachweis maligner Lymphome (z. B. Klonalitätsanalysen von Immunglobulinen und T-Zell-Rezeptoren) und anderer hämatologischer Neoplasien quantitativ im Vordergrund.

Im Vordergrund der Tätigkeit des zytogenetischen Labors - sowohl diagnostisch als auch wissenschaftlich - steht momentan eine Variante der molekularen Zytogenetik, die Fluoreszenz in-situ-Hybridierung (FISH). Damit lassen sich selektiv beliebige DNA-Sequenzen bzw. Gene in den Kernen von Zellen der untersuchten Gewebe (hauptsächlich Schnitte von Paraffin-Präparaten) nachweisen.

FISH beruht auf der Paarung von komplementären Basen zweier Nukleinsäure-Stränge: von Sonde und Zielsequenz. Zum Nachweis bestimmter Gene bzw. chromosomaler Veränderungen im zu untersuchenden Gewebe wird dieses mit kommerziell erhältlichen "Sonden" (DNA-Stränge definierter Sequenz) kultiviert. Dank Markierung der Sonden mit fluoreszierenden Molekülen lassen sich anschließend im Fluoreszenz-Mikroskop DNA-Hybride (bestehend aus Sonde und Zielsequenz) in situ (d. h. direkt im untersuchten Gewebe) nachweisen. Dergestalt können sehr viel kleinere Chromosomendefekte nachgewiesen werden als in der klassischen Zytogenetik.

FISH hat in der Zumorzytogenetik (Untersuchung des Genoms von Tumorzellen auf chromosomale Umbauten) große Bedeutung erlangt, sowohl in der Forschung, als auch diagnostisch, weil manche chromosomale Umbauten (z. B. Translokationen) bei bestimmten Tumorarten gehäuft auftreten, so z. B. das sog. Philadelphia-Chromosom bei der chronischen myeloischen Leukämie.

Im zytogenetischen Labor des Pathologischen Instituts der Universität Würzburg dient FISH hauptsächlich der Differenzialdiagnostik von Non-Hodgkin-Lymphomen, deren zahlreiche, schwierig zu unterscheidende Untergruppen teilweise charakteristische genetische Veränderungen zeigen. Zur Zeit sind im Labor ca. 15-20 FISH-Sonden im Einsatz. Pro Woche erfolgen etwa 20-30 FISH-Untersuchungen, die jeweils 2-5 Tage in Anspruch nehmen.

Häufig wird die Pathologie immer noch in erster Linie mit Sektionen assoziiert. Dabei spielen diese mittlerweile in ihrem Arbeitsalltag eine untergeordnete Rolle. Dies liegt vor allem an der dramatischen Zunahme der Histopathologie, aber auch an der in den letzten Jahrzehnten stark rückläufigen Sektionsfrequenz. Ursächlich ist z. T. das mangelnde Interesse der Kliniker, die sich dank der enormen Fortschritte der apparativen Untersuchungsverfahren (z. B. Bildgebung) ihrer Diagnosen so sicher sind, dass ihnen eine sektionspathologische Überprüfung entbehrlich erscheint. Teilweise fehlt auch das Einverständnis der Angehörigen, obwohl Sektionen weder Aufbahrung noch Bestattung der Verstorbenen beeinträchtigen. Trotzdem hat die Sektion ihre traditionelle Rolle in der Qualitätskontrolle der klinischen Diagnostik nicht verloren.

Unter den verschiedenen Sektionstypen (z. B. nach dem Bundesseuchengesetzt bei Verdacht auf eine meldepflichtige ansteckende Erkrankung oder versicherungsinduziert zur Klärung finanzieller Ansprüche) steht die sog. klinische Sektion bei weitem im Vordergrund. Bei ihr geht es um die Aufklärung von Todesursache und Erkrankungen des Verstorbenen. Im Gegensatz dazu gehören forensische Obduktionen, welche der Aufklärung einer Straftat (z. B. Mord) dienen, in den Zuständigkeitsbereich der Rechtsmedizin. Geographisch ist das pathologische Institut zuständig für die Durchführung von Sektionen nicht nur in Würzburg und Umgebung, sondern darüberhinaus in Krankenhäusern großer Teile Unterfrankens. Das Altersspektrum der Autopsien hat sich in den letzten Jahren verlagert, weg vom Ende der natürlichen Lebenspanne hin zu ihrem Anfang, d. h. in den Bereich der Totgeburten (prä- und perinatal). Auch bei diesen sog. fetalen Obduktionen geht es um die Aufklärung von Erkrankungen wie z. B. Fehlbildungen.

Eine klinische Obduktion erfolgt auf schriftlichen Antrag (Formular) durch den verantwortlichen Arzt des Verstorbenen. Voraussetzung ist i. d. R. das Einverständnis der Angehörigen sowie eine natürliche Todesursache. Sofern keine erschwerende Umstände, wie z. B. Voroperationen mit starken Verwachsungen, vorliegen, dauert eine Autopsie bei Erwachsenen ca. 2-3 Stunden und erfolgt nach einem standardisierten Verfahren. Dabei wird nach Eröffnung von Brustkorb und Bauch zuerst das Herz entnommen, danach Lungen, Oberbauchorgane (Leber, Magen, Milz und Pankreas), Ausscheidungsorgane (Nieren mit Nebennieren, Blase) sowie Darm. Die Standardsektion schließt meistens mit der Eröffnung des Schädels. Der makroskopische Sektionsbefund wird anschließend durch die histologische Begutachtung der verschiedenen Organe ergänzt. Danach erfolgt die endgültige pathologische Begutachtung.

Vor den sektionsprozeduralen Reformen Rudolf Virchows beschränkte sich der Pathologe bei Sektionen auf die den Kliniker interessierenden Aspekte. Aber erst ab ca. 1875, d. h. nach Durchsetzung der Reformen (u. a. Einführung der standardisierten Sektion, welche in fester Reihenfolge alle Organe des Körpers begutachtet), konnte die Leichenschau ihre enorme Bedeutung im Rahmen der Qualiltätskontrolle der damals noch primitiven medizinischen Diagnostik gewinnen. Nachdem über 100 Jahre später die enormen Forschritte der bildgebenden Diagnostik es dem Arzt erlauben, mit hoher Auflösung auch in die entferntesten Winkel der Körpers zu schauen, konzentriert sich der sezierende Pathologe wieder mehr auf die klinischen Vorgaben trotz Beibehaltung der standardisierten Vorgehensweise.