Labore

Zur korrekten Diagnose benötigt der Pathologe qualitativ hochwertige Schnitte (für die mikroskopische Diagnostik) sowie häufig weitere analytische Untersuchungsergebnisse, deren Erstellung Aufgabe folgender Labors ist.

Das Eingangslabor ist die zentrale Annahmestelle für alles zur Diagnostik in das Pathologische Institut geschickte Untersuchungsmaterial. Dementsprechend ist es unübersehbar direkt gegenüber dem Haupteingang lokalisiert. Überwiegend treffen die Einsendungen morgens ein; der Rest über den Tag verteilt. Neben einzelnen Proben gibt es Sammeleinsendungen von Großeinsendern wie z. B. Kliniken und Krankenhäusern. Die größten Einsender schicken Sammeleinsendungen 2 x täglich, morgens und frühnachmittags.

Während zytologische und hämatologische Proben direkt an die entsprechenden Labors weitergeleitet werden, erfolgen die ersten Verarbeitungsschritte von histologischen Einsendungen - also des weit überwiegenden Anteils - noch im Eingangslabor.

• Biopsien werden von MTAs direkt eingekapselt und zur weiteren histotechnischen Aufarbeitung an das histologische Labor weitergeleitet.
• Resektate dagegen (also i. d. R. onkologische Operationspräparte), insbesondere große, werden zunächst 24 Stunden in Formalin fixiert, bevor sie von Pathologen detailliert beschrieben (Makrodiktat) und zugeschnitten werden. Anschließend wird das diagnostisch relevante Material in analoger Weise wie Biopsien eingekapselt und der weiteren histotechnischen Aufarbeitung zugeführt.

Während Biopsien vollständig eingekapselt (und dann eingebettet) werden, ist dies bei Resektaten i. d. R. nicht möglich, da sie zu groß sind. Statt dessen beschränkt man sich hier auf die für die Beurteilung entscheidenden Abschnitte, wie z. B. seine Ränder, die wichtig sind für die Beurteilung, ob ein Tumor im gesunden Gewebe entfernt wurde. Die Identifizierung und Isolierung dieser Partikel ist die Aufgabe des Zuschneiders. Von großen Operationspräparten werden häufig 10 oder mehr Bereiche eingekapselt, insbesondere eine größere Anzahl von Lymphknoten (zur Beurteilung von deren Tumorbefall oder -Freiheit).

Das im Eingangslabor eingekapselte Material - egal ob Biopsie oder Resektat - wandert anschließend ins histologische Labor zur weiteren histotechnischen Aufarbeitung (z. B. Paraffineinbettung).

Im zytologischen Labor werden aus dem eingegangenen zellhaltigen Untersuchungsmaterial Ausstriche und Schnitte für die mikroskopische Beurteilung durch die Pathologen angefertigt. Das Labor befindet sich im Tiefgeschoss des Instituts im Raum 126.

Die Aufarbeitung ist abhängig von der Art des eingesendeten Materials:

• Nativmaterial wird unverzüglich bearbeitet, da es unfixiert schon nach kurzer Verweildauer diagnostisch unbrauchbar wird.
• Größere Flüssigkeitsmengen in Gefäßen (z. B. Urin oder Pleurapunktat) werden nach dem Fixieren zuerst zentrifugiert. Anschließend wird das zellhaltige Sediment auf Glasobjektträger ausgestrichen und gefärbt, abschließend fixiert.
• Bereits auf Objektträger ausgestrichene Punktate brauchen nur noch gefärbt zu werden.

Eine Besonderheit der Aufarbeitung besteht darin, dass zellhaltiges Material, zusätzlich zu den Ausstrichen, regelmäßig in Paraffin eingebettet wird (Zellblockpräparate). Dies gelingt i. d. R. durch Versetzen des per Zentrifugieren erhaltenen, zellhaltigen Sediments mit speziellem Rinderserum, welches die sedimentierten Zellen mit seinen Antikörpern verfestigt und damit einbettfähig macht. Das Einbetten in Paraffin selbst erfolgt, genauso wie bei histologischem Gewebe, im Eindeckautomat (Autotechnikon). Auch das weitere Procedere zur Herstellung mikroskopfähiger Schnitte unterscheidet sich nicht von der Histotechnik. Als Folge dieser zweigleisigen Verarbeitungsweise können die Pathologen dasselbe Zellmaterial im Ausstrich und Schnitt mikrokopisch begutachten, ein duales Verfahren, welches die Zuverlässigkeit der zytologischen Diagnostik steigert.

Diese wird einer kontinuierlichen Qualitätskontrolle unterzogen, indem positive (Krebszellen) wie negative (keine Krebszellen) Befunde kontinuierlich mit - falls vorhanden - korrespondierenden histologischen Befunden verglichen werden.

Die Qualität des eingesandten Material differiert erheblich und hat einen entscheidenden Einfluss auf die Begutachtung. Am wichtigsten ist neben einer korrekten Technik der Materialentnahme ein guter Erhaltungszustand der Zellen, der eine korrekte  Konservierung bzw. Fixation erfordert, falls das Untersuchungsgut nicht unverzüglich auf kürzestem Wege in die Pathologie gebracht wird (vgl. Empfehlungen zu Entnahme und Versand).

Das hämatologische Labor ist das Hauptlabor für das Referenz- und Konsultationszentrum für Lymphknotenpathologie bzw. den hämatopathologischen Schwerpunkt des Instituts. Sein Einlauf besteht hauptsächlich aus

• Paraffinblöcken von Lymphomen zur Referenzbegutachtung, eingesendet von den erstbegutachtenden Pathologen
• Knochenmarksstanzen, im pathologischen Jargon im Hinblick auf den häufigsten Entnahmeort auch als "Beckenkämme" bezeichnet, i. d. R. begleitet von Ausstrichen von Knochenmark und peripherem Blut
• Lymphknotenbiopsien und Tonsillen zur Begutachtung außerhalb des Referenzzentrums.

Die histotechnische Aufarbeitung der Knochenmarksstanzen erfordert vor der Paraffineinbettung noch eine besondere Fixierung und Entkalkung, die allein zwei Tage in Anspruch nehmen. Dagegen können zur Referenzdiagnostik eingehende Paraffinblöcke sofort geschnitten, auf Objektträger aufgezogen und gefärbt werden.

Die hämatologische Färbung bildet den Schwerpunkt der Tätigkeit des Labors. Zur Verfügung stehen ca. 15-20 verschiedene Färbungen, von denen die meisten nur bei speziellen Fragestellungen zum Einsatz kommen. Standardmäßig werden Lymphknoten dreifach gefärbt (HE, Giemsa, PAS), Beckenkämme fünffach (zusätzlich Eisenfärbung und Versilberung). Im Unterschied zur automatischen Schnittfärbung im histologischen Eingangslabor wird im hämatologischen Labor zur Erzielung eines optimalen Ergebnisses manuell gefärbt. Dies dauert zwar länger, erlaubt jedoch eine flexiblere Anpassung der Färbebedingungen (z. B. Einwirkungszeit). Die Färberezepte und ihre virtuose Handhabung bilden einen wesentlichen Teil des know-how des hämatologischen Labors, auf dem der hämatologische Schwerpunkt des Instituts basiert.

Das IHC-Labor am Pathologischen Institut besteht seit über 20 Jahren. Seine Bedeutung ist seitdem - parallel zur Bedeutung der Immunhistochemie in der pathologischen Diagnostik generell - ständig gewachsen, was sich in seinem Arbeitsvolumen von ca. 500 Färbungen pro Tag (entspr. > 100.000 Färbungen pro Jahr) spiegelt. Hauptanwendungsgebiete sind die Hämatopathologie mit dem Referenzzentrum für Lymphknotenpathologie sowie die allgemeine Tumordiagnostik

Momentan sind ca. 150 Antikörper im Einsatz:

• Hämatologische Marker: ca. 55
  • davon 34 lymphozytäre Marker (z. B. CD2-5, CD7-8, IGA,- G, -D, -M)
• Epitheliale Marker: ca. 20 (z. B. (AE1/AE3) 
• Hormonelle Marker: 15 (z. B. Östrogen, Progesteron, Her2/neu)
• Marker für Aktivierung und Proliferation: 10 (z. B. Ki67)
• Marker von Erregern: 10 (z. B. HBC, HBS, HSV, HPV)
• Neurale Marker: ca. 10 (z. B. Neurofilamente)
• Sonstige Marker: über 30 (z. B. Amyloid A, AFP, CEA)

Der hämatologische Schwerpunkt des Instituts spiegelt sich in der großen Anzahl von hämatologischen Markern (55), die zudem durchschnittlich häufiger zum Einsatz kommen als die übrigen. So besteht die Standard-Hodgkin-Serie aus sechs Färbungen. Bei besonders schwierigen Konsultationsfällen kann diese Zahl noch übertroffen werden.

Die AK-Färbung ist ein relativ aufwendiges Verfahren. Um die großen Probenvolumina zu bewältigen, wird ein Färbeautomat benutzt, der 300 Färbungen pro Durchlauf schafft und auch die Durchführungsbedingungen standardisiert, ein wichtiger Punkt, da die Färbungen auf eine Vielzahl von Faktoren - wie Temperatur, Konzentration diverser Ingredienzien, Inkubationszeit, pH - empfindlich reagieren. Trotzdem bleibt im IHC-Labor noch viel manuelle Arbeit zu tun, sowohl vor der automatischen Färbung (Schneiden der Blöcke und Aufziehen der Schnitte auf Objektträger, Entparaffinierung, Rehydrierung und Defixierung des Gewebes) als auch danach (Gegenfärbung mit Hämalaun, Dehydrierung und Folieneindeckung der Schnitte). Durch die Entwicklung von Automaten der 2. Generation, welche einige dieser Arbeitsschritte zusätzlich automatisieren, zeichnet sich hier eine gewisse Entlastung ab, ohne welche die zu erwartende weitere Steigerung der Färbezahlen nicht zu bewältigen wäre. Nur erwähnt seien abschlileßend drei weitere wichtige Aufgaben im Labor:

• Qualitätskontrolle der Routinefärbungen
• Spezialfärbungen in unfixiertem (frischem) Gewebe
• Entwicklung, Testung und Optimierung neuer Färbeprotokolle für neue AK

Das Labor für molekulare Pathologie ist in den knapp 15 Jahren seit seiner Gründung 1998 parallel zur Bedeutungszunahme der Molekularpathologie kontinuierlich gewachsen. Neben der Forschung (z. B. Entwicklung neuer molekulargenetischer Nachweisverfahren) steht die Durchführung bereits etablierter Tests zur Klärung diagnostischer Fragen im Vordergrund seiner Tätigkeit. Momentan umfasst das Untersuchungsspektrum ca. zwei Dutzend Tests im Rahmen der Diagnostik folgender Krankheitsgruppen:

• Gastrointestinale Neoplasien (z. B. c-Kit, K-RAS)
• Maligne Lymphome (Klonalitätsanalysen)
• Andere hämatologische Neoplasien (z. B. MPS, CML, AML M3, MDS/AML)
• Sarkome (z. B. verschiedene Translokationen)
• Infektiöse Erreger (z. B. MTB, HHV8, Kardioviren)

Entspr. dem hämatopathologischen Schwerpunkt des Instituts (Referenzzentrum für Lymphknotenpathologie) dominieren in der täglichen Routine Klonalitätsanalysen (von Immunglobulinen und T-Zell-Rezeptoren) zum Nachweis maligner Lymphome (pro Woche ca. 50-100).

Methodisch basieren die Tests überwiegend auf der Polymerase-Ketten-Reaktion, Sequenziertechniken und Elektrophorese. Soweit der eigentliche Test auf DNA-Basis erfolgt, kann paraffiniertes Ausgangsmaterial verwendet werden, das nach Entparaffinierung (Xylol) enzymatisch (Proteinasen) verdaut wird, worauf spezifische, dabei erhaltenen Nukleotide mittels PCR selektiv amplifiziert und anschließend nachgewiesen werden (z. B. per Fragmentanalyse). Für Tests auf der Basis von RNA (z. B. Nachweis hämatopoetischer Neopasien, u. a. CML, AML M3, MDS/AML) kommt Paraffinmaterial dagegen wegen der Instabilität von RNA nicht in Frage. Statt dessen ist hier natives (unfixiertes) Material, für die hämatologische Diagnostik z. B. Blut oder Blutausstrich, erforderlich.

Die Zytogenetik ist eine Methode zur Untersuchung der Chromosomen auf pathologische Veränderungen. Deshalb spielt sie in Diagnostik ebenso wie in der Forschung eine wichtige Rolle. Im Institut für Pathologie der Universität Würzburg ist die klassische Zytogenetik (Chromosomen-Bänderungsanalyse) schon seit ca. 20 Jahren (ab 1990) im Einsatz. Seit 2002 wird sie durch die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (abgekürzt FISH) ergänzt bzw. verdrängt.

Im zytogenetischen Labor des Pathologischen Instituts der Universität Würzburg dient FISH hauptsächlich der Differenzialdiagnostik von Non-Hodgkin-Lymphomen, deren zahlreiche, schwierig zu unterscheidende Untergruppen teilweise charakteristische genetische Veränderungen zeigen. Zur Zeit sind im Labor ca. 15-20 FISH-Sonden im Einsatz. Pro Woche erfolgen etwa 20-30 FISH-Untersuchungen, die jeweils 2-5 Tage in Anspruch nehmen.

Im Zentrum für Operative Medizin (ZOM) betreibt das Institut für Pathologie ein Labor zur Versorgung der dort angesiedelten Kliniken (Allgemeinchirurgie, Herz-Thorax-Chirurgie, Urologie) mit Schnellschnitt- und histologischer Diagnostik. Die Räumlichkeiten in der Nähe der OPs im ZOM stellte das Universitätsklinikum dem Institut für Pathologie zur Optimierung der Krankenversorgung und für wissenschaftliche Kooperationen zur Verfügung.

Von der räumlichen Nähe profitiert insbesondere die Schnellschnittdiagnostik: Von den 12 OPs im ZOM gelangt das Gewebe per Rohrpost ins Labor, wo es schon dank Schnellschnitt-Vormerkung im online-OP-Plan erwartet wird. So können Schnellschnitte innerhalb kürzester Zeit angefertigt und befundet werden. Auch die histologische Diagnostik für die im ZOM angesiedelten operativen Fächer wird hier umgehend durchgeführt.

Das Pathologie-Labor im ZOM ist modern ausgestattet mit Zuschneideplatz, Mikrotom, Färbe- und Eindeckautomat. Das im Laufe eines Arbeitstages zugeschnittene und eingekapselte Gewebe wird abends gesammelt in das histotechnische Labor des Haupthauses zur Einbettung gebracht und geht frühmorgens sofort ins ZOM zurück zur weiteren histotechnischen Aufarbeitung: Gießen von Paraffinblöcken, Schnittherstellung am Mikrotom, Aufziehen auf Objektträger, Färben, Eindecken. Die Begutachtung erfolgt durch den diensthabenden Pathologen im ZOM-Labor. Für Konsultationszwecke mit Spezialisten im Haupthaus steht ihm eine telepathologische Verbindung zur Verfügung, welche das gemeinsame Betrachten des mikroskopischen Bildes am Monitor erlaubt.